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顶空气相色谱系列讲座(18)
点击次数:1309 发布时间:2015-09-01

顶空气相色谱系列讲座(18)  

人体血液中一氧化碳的分析——分光光度法定量5





三、分光光度法

1、紫外光谱法原理

CO中毒血中可能含有三种血红蛋白: ⑴碳氧血红蛋白(HbCO)——与CO结合的Hb; ⑵ 氧合血红蛋白——与O2结合的Hb  ⑶血红蛋白——没结合的Hb。 它们在500nm~600nm范围内吸收光谱见图-2。碳氧血红蛋白zui大吸收峰分别在568.2nm和538nm;氧合血红蛋白zui大吸收峰分别在576.2nm和542nm;血红蛋白zui大吸收峰在555nm。如血液含三种形式的血红蛋白(其中的微量高铁血红蛋白可忽略不计),则其光谱呈现三种光谱的混合形。如在血液中加入还原剂(连二亚硫酸钠或硫化铵)溶液,则可将氧合血红蛋白及高铁血红蛋白还原为血红蛋白,而碳氧血红蛋白不被还原,因而血液中只存在碳氧血红蛋白和血红蛋白两种不同的形式,它们的吸收光谱见图-1





用分光光度法测定血中HbCO定性和定量是基于HbCO和对光谱的特征吸收不同,和特征吸收与浓度有量的关系。HbO2在589nm~577nm和556nm~536nm区间有两条吸收谱带,其zui大吸收是579nm和542nm。HbCO在579nm~564nm和548nm~530nm区间有两条吸收谱带,其中zui大吸收是572nm和539nm。加入还原剂后检血中HbO2和高铁血红蛋白被还原为血红蛋白(Hb),此时吸收谱带变为一条,即在530nm~580nm之间,zui大吸收为556nm。而HbCOzui大吸收波长仍是572nm和539nm不变。

2、具体操作步骤

取CO中毒心血(检材血)0.1ml~0.3ml,加10ml 0.1%硫化铵或多硫化铵水溶液(内含连二亚硫酸钠2.5mg/ml)稀释混匀,测定500nm~600nm之间的吸收图谱,用切线法量取555nm和540nm处的吸收值见图-2,计算血中HbCO% = F ×(A540/B555)×100公式,式中F为常数1.5;A540见图-2中a~b(cm)线段长;B555见图-2中c~d(cm)线段长。此法适合检材血中含量HbCO% > 40% 时效果好,此方法在办案中使用较多。

3、另一种经验方法

    适合各种CO浓度检材血的HbCO%测定,用0.4%氨水溶液稀释的含CO血在529nm和582nm处有吸收峰,稀释液做参比。根据经验公式:HbCO% = (A529-A582)×185/(A529-0.07)进行计算。185和0.07均为经验常数,本方法要求稀释检材血的吸光度值在0.4~0.6范围准确度高。

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